MÉTODOS DE TINCIÓN DE GELES
TINCIÓN | Sensibilidad | Rango lineal (órdenes de magnitud) | Compatibilidad MS |
Azul Coomassie G-250 | 8-50 ng | 2 | ++++ |
Plata (Merril et al. 1979) | 0,5-1 ng | 1 | No compatible |
Plata compatible con masas | 0,5-1 ng | 2 | ++ |
Sypro Ruby | 0,5-1 ng | 3 | ++++ |
Flamingo | 0,5-1 ng | 3 | ++++ |
TINCIÓN CON AZUL COOMASSIE G-250
1. Lavar 3 - 5 min con agua Milli-Q.
2. Fijar el gel con 40% metanol, 10% ácido acético y 50% H2O durante al menos 1 h.
3. Lavar el gel durante 10 min. en agitación con H2O Milli-Q. Repetir 2 veces más.
4. Teñir el gel en solución de tinción Coomassie con suficiente cantidad para cubrir el gel.
5. Agitar suavemente durante 1 hora.
6. Lavar durante 30 min con H2O Milli-Q. Repetir 2 veces más.
7. Envolver el gel con film transparente. Escanear el gel si se quiere guardar una imagen del mismo. No tocar el gel directamente.
8. Guardar el gel en agua Milli-Q o en ácido acético (1 - 2%).
(SYPRO® Ruby Protein StainsInstruction Manual)
1. Retirar el gel de los cristales o placas. Colocarlo en un contenedor o bandeja de plástico. Para geles 2-D, lavar durante 30 minutos en una de las siguientes soluciones fijadoras:
10% metanol, 7 % ácido acético
25% etanol, 12.5% ácido tricloroacetico
10% etanol, 7% ácido acético
50% etanol, 3% ácido acético
40% etanol, 10% ácido acético
(Para geles 1-D no es necesaria la fijación)
2. Retirar la solución de lavado y cubrir el gel con SYPRO Ruby. Los volúmenes utilizados para geles estándar se proporcionan más abajo. En general usar 10 veces el volumen del gel. El uso de poca cantidad de Sypro puede reducir la sensibilidad.
Tamaño del gel |
Volumen de solución de tinción |
8 x 10 cm |
50 ml |
16 x 20 cm |
330 ml |
20 x 20 cm |
500 ml |
4. Lavar el gel en 10 % metanol (o etanol) y 7 % ácido acético durante 30 - 60 min. para disminuir el fondo fluorescente.
5. Lavar el gel con agua antes de escanear.
Nota: El uso de SYPRO Ruby muestra dificultades para teñir glicoproteínas y lipoproteínas
Escaneado y obtención de imagen del gel 1D o 2D
SYPRO Ruby tiene 2 máximos de excitación a 280 nm y a 450 nm, y un máximo de emisión próximo a 610 nm. Las proteínas teñidas pueden ser visualizadas utilizando una gran variedad de fuentes de excitación incluidas UV 300 nm, transiluminador de luz azul y sistemas basados en láser. SYPRO Ruby tienen una excepcional fotoestabilidad y un largo tiempo de vida de emisión, permitiendo largas exposiciones mientras se minimiza el ruido de fondo.
TinciONES CON plata (compatibleS con espectrometría de masas)
PROTOCOLO 1 Schevchenko, A. et al. (1996) Anal. Chem .68 , 850-858
1. Fijar el gel en metanol 50 % y ácido acético 5 % durante 20 min.
2. Lavar el gel en metanol 50 % durante 10 min.
3. Lavar el gel en H2O Milli-Q durante al menos 2 horas (El lavado durante toda la noche es mejor porque reduce el fondo en la tinción).
4. Sensibilizar el gel en Na2S2O3 al 0,02 % durante 1 min.
5. Lavar el gel 2 veces en H2O durante 1 min. cada vez.
6. Incubar el gel en AgNO3 al 0,1% durante 20 min. a 4ºC
7. Lavar el gel en H2O durante 1 min.
8. Transferir el gel a un contenedor limpio.
9. Lavar el gel en H2O durante 1 min.
10. Revelar el gel en formalina (35% formaldehído) al 0,04 % y Na2CO3 al 2 %.
11. Cambiar la solución de revelado cuando el revelador cambie a amarillo.
12. Parar la tinción con acético al 5 %.
13. Cambiar la solución de acético al 5 % al menos 2 veces.
14. Guardar el gel at 4º C en acético al 1 %.
PROTOCOLO 2 Adaptado de Blum et al, Electrophoresis, 8, pp93-99, 1987 y Schevchenko, A. et al. (1996) Anal. Chem. 68, 850-858
1. Lavar el gel en etanol al 50% y ácido acético al 5% durante 1 h.
2. Lavar el gel en etanol al 50% durante toda la noche.
3. Lavar el gel en H2O Milli-Q 3 veces durante 10 min
4. Sensibilizar el gel en Na2S2O3.5H2O al 0,02% durante 1 min.
5. Lavar el gel en H2O fría 3 veces durante 30 s
6. Incubar el gel en AgNO3 0,1% durante 20 min. a 4ºC
7. Lavar el gel en H2O 3 veces durante 20 s
8. Transferir el gel a un contenedor limpio
9. Lavar el gel en H2O durante 1 min.
10.Revelar el gel en formalina al 0,05%, Na2CO3 al 3% (para hacer 500 ml de formalina al 0,05% se necesita 0.25 ml de formaldehído al 37%)
11. Cambiar la solución cuando el revelador cambie a amarillo.
12. Parar la tinción con ácido acético al 5 %
13. Lavar el gel 3 veces durante 10 min con H2O Milli-Q
14. Guardar el gel a 4º C en acético al 1%.